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| 沙棘黄酮口服液中芦丁和５＿羟色胺的毛细管区带电泳电化学检测 |
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作者： 转载自： 发布日期：2014-9-17
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沙棘（ＨｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓＬ．）用于医药具有悠久的历史,我国藏医学巨著《四部药典》中即对沙棘的医药价值进行过描述。沙棘果是我国藏、蒙医药的常用药。根据现代药理研究,沙棘果中含有多种黄酮类物质、氨基酸以及生物活性物质,如芦丁、苦木素、５＿羟色胺等,具有调节血脂、降低胆固醇、活血化淤、软化血管及增强心脑供血等功能。目前测定芦丁和５＿羟色胺的常用方法有高效液相色谱法、荧光法及化学发光法等，这些方法存在操作麻烦或灵敏度低的缺点。
毛细管电泳（ＣＥ）作为一种分离方法以其高效、快速,进样量少及灵敏度高等优点得到了广泛的应用，已用于植物中芦丁等黄酮类物质的测定，但其所用的紫外检测器灵敏度较低。未见有同时测定芦丁和５＿羟色胺的报道。我们尝试采用毛细管电泳电化学检测法（ＣＥ-ＥＤ）测定芦丁和５＿羟色胺，实验结果证明本法简单、快速,灵敏度高，用于中药沙棘黄酮口服液中芦丁和５＿羟色胺的测定,结果令人满意。
１实验部分
１． １仪器与试剂
毛细管电泳电化学检测系统（ＣＥ-ＥＤ）为自组装，包括３０ｋＶ高压电源（上海原子核研究所），ＬＣ＿４Ｃ安培检测器（ＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ），ＬＫＢ＿ＲＥＣ＿１型记录仪（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ），熔融石英毛细管（６０ｃｍ×２５μｍｉｄ，ＰｏｌｙｍｉｃｒｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）。
芦丁和５＿羟色胺购自Ａｌｄｒｉｃｈ公司（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）。其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水,样品沙棘黄酮口服液购自山西爱心生物技术开发中心。
１． ２实验方法
实验中采用柱端射壁(ｗａｌｌ＿ｊｅｔ)电化学检测系统,电化学检测池为三电极体系:３００μｍ碳圆盘电极为工作电极,碳电极的制作参见文献,饱和甘汞电极(ＳＣＥ)为参比电极,铂丝为辅助电极。通过三维定位调节仪使工作电极与毛细管出口在一条直线上,并紧靠毛细管末端。采用电动进样,在１５ｋＶ进样电压下从毛细管阳极端进样６ｓ,检测池为阴极电泳槽。缓冲液:５０ｍｍｏｌ／Ｌ硼酸盐（ｐＨ为８．５）。实验前将分离毛细管依次用０．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ、二次蒸馏水、缓冲溶液清洗。
１． ３溶液配制
芦丁和５＿羟色胺标准储备液：５．０×１０-３ｍｏｌ／Ｌ，用５０ｍｍｏｌ／Ｌ硼酸盐缓冲液（ｐＨ８．５）-乙醇（体积比５０∶５０）混合溶液溶解配制；其他浓度标准溶液均用运行缓冲溶液稀释得到，并置于４℃冰箱中避光保存。
１． ４实验步骤
使用前，碳圆盘电极依次用Ｍ５金相砂纸和Ａｌ２Ｏ３磨光，于双蒸水中超声清洗。毛细管电泳实验测试条件，除特别指明外，使用１５ｋＶ的分离电压，运行缓冲液为５０ｍｍｏｌ／Ｌ硼酸盐（ｐＨ８．５）,检测电极电位为０．９０Ｖ（ｖｓＳＣＥ）。此外，所有的溶液在进样前均需经０．２２μｍ聚丙烯滤膜过滤。
２结果与讨论
２．１电泳条件的选择
２．１．１流体动力学伏安图
由图１可见，芦丁和５＿羟色胺峰电流在０．６０Ｖ处快速上升，至０．９０Ｖ后峰电流(Ｉ)上升幅度减小，继续提高电极电位虽然可以提高峰电流，但此时本底电流大幅增加，噪声明显提高，故选择检测电位Ｖ为０．９Ｖ（ｖｓＳＣＥ），信噪比较高，电极的稳定性较好。
２．１．２运行缓冲液酸度及浓度的影响
研究了硼酸盐缓冲液的酸度和浓度对分离的影响。分别以不同ｐＨ的硼酸盐为运行缓冲液，经试验选择最佳运行液酸度为ｐＨ８．５，此时２种组分可完全分离,且分析时间较短,峰高也较理想。当酸度为８．５时，随运行缓冲液浓度升高，芦丁和５＿羟色胺的迁移时间和分离度增加，而浓度高于５０ｍｍｏｌ／Ｌ时，分离度增加缓慢而噪声增加使得信噪比降低，综合考虑选择５０ｍｍｏｌ／Ｌ硼酸盐缓冲液（ｐＨ８．５）为运行缓冲液。
２．１．３分离电压及进样时间的选择
研究了电泳分离电压对被测物分离测定的影响。综合考虑２组分的分离度、灵敏度和分析时间等因素，确定１５ｋＶ为最佳分离电压。在１５ｋＶ进样电压下，选择进样时间分别为２、４、６、８、１０和１２ｓ，测定组分的峰高与进样时间的关系,发现６ｓ后峰高增加缓慢且电泳峰展宽，并出现峰拖尾等现象，故最佳进样时间选择为６ｓ（１５ｋＶ）。２．２重复性、线性范围及检出限
在选定的最佳分离测定条件下,将５．０×１０-４ｍｏｌ／Ｌ芦丁和５＿羟色胺混合标准溶液连续进样７次，重复性良好,峰高的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为２．５%和３．８%，迁移时间的ＲＳＤ分别为０．８%和１．２%。典型的电泳图谱见图２。
配制一系列不同浓度的芦丁和５＿羟色胺的混合标准溶液，在选定的最佳条件下进行测定，２组分浓度与电泳峰电流分别在２．０×１０-６～１．０×１０-４ｍｏｌ／Ｌ和５．０×１０-７～５．０×１０-３ｍｏｌ／Ｌ范围内呈良好线性关系，检出限（噪声电流３倍值对应浓度）分别为３×１０-７ｍｏｌ／Ｌ和８×１０-８ｍｏｌ／Ｌ。
２． ３样品测定及回收率实验
在最佳条件下，按照上述实验方法，测定沙棘黄酮口服液中芦丁和５＿羟色胺含量，典型的电泳图见图３，采用加标法进行回收率实验，结果见表１。
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