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| 高效液相-电化学检测法测定大鼠血浆灯盏乙素浓度及其药代动力学 |
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作者： 转载自： 发布日期：2014-9-15
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短葶飞蓬(Ｅｒｉｇａｒｏｎｂｒｅｖｉｓｅａｐｕｓ)俗称灯盏花,是我国云南特有的中药品种,临床用于治疗脑血栓形成、脑栓塞、多发性神经炎等脑血管意外所致的瘫痪症。其有效成分灯盏乙素(ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｎ)为从多年生菊科植物短亭飞蓬提取的黄酮类成分,因此其制剂有的称灯盏花素注射液,为同方异名产品;有改善血液流变学及微循环、增加脑血流量、抗心肌缺血、提高机体耐缺氧能力等作用。临床常用于中风后遗症、冠心病心绞痛或视网膜静脉栓塞等。灯盏乙素的国内外研究多集中于其药理作用和临床应用,而关于灯盏乙素在体内的药代动力学的研究较少。本文建立了血浆中灯盏乙素浓度测定的电化学高效液相色谱法,并对其在大鼠体内的药代动力学进行了研究。
1 材料和方法
1.1 仪器
ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ-4ＡＨＰＬＣ定量分析系统由ＳＰＤ-2ＡＳ紫外检测器、ＬＣ-4Ｃ电化学检测器、Ｃ-Ｒ2ＡＸ型积分仪组成;ＬＤ5-2Ａ离心机(北京医用离心机厂)。
1.2 药品与试剂
灯盏乙素(军事医学科学院提供,纯度97.5%以上);乙睛、甲醇为色谱纯;磷酸二氢钠等为分析纯,水为超纯水。
1.3 实验动物
雄性ＳＤ大鼠,体重230ｇ～280ｇ,清洁级(军事医学科学院实验动物中心提供)。
1.4 色谱条件
色谱柱:ＨｙｐｅｒｓｉｌＣｌ8(ＩＤ150ｍｍ×4.6ｍｍ,5μｍ,);预柱:Ｃ18(5ｍｍ×4.6ｍｍ,40μｍ);柱温:室温;流动相:酸盐缓冲液-甲醇-乙睛(65∶35∶10)调至ｐＨ3.0;流速:0.6ｍＬ/ｍｉｎ;化学检测器设定:电极:Ａｇ/ＡｇＣｌ参比电极,氧化模式;检测电压:0.6ｖ;量程:5ｎＡ
1.5 血浆样品处理
取抗凝的大鼠血浆(小鼠组织置于5倍体积的生理盐水中匀浆)200μＬ,加入2ｍＬ甲醇,振荡1ｍｉｎ,离心(3500ｇ,5ｍｉｎ),二次液-液萃取后,合并有机相并于40℃氮气流下吹干,残留物用甲醇200μＬ溶解,涡流ｌｍｉｎ,离心后取上清液20μＬ进行色谱分析。
2 结果
2.1 色谱行为
在上述色谱条件下,空白血浆、含药血浆和实测血浆的色谱如图ｌ所示,色谱分离良好。保留时间为10.8ｍｉｎ。
2.2. 见图1
2.3标准曲线
取大鼠空白血浆0.2ｍＬ,加入灯盏乙素系列标准溶液50μＬ,配制成血浆样品终浓度为5ｎｇ/ｍＬ、10ｎｇ/ｍＬ、100ｎｇ/ｍＬ、500ｎｇ/ｍＬ、1000ｎｇ/ｍＬ,按“血浆样品处理”项下操作,以色谱峰面积对浓度作线性回归。回归方程为Ｙ=-0.65852+0.995689Ｘ(ｒ=0.9999)。最低检测质量浓度为5ｎｇ/ｍＬ。
2.4 回收率与精密度
用大鼠空白血浆配制含灯盏乙素分别为10ｎｇ/ｍＬ、100ｎｇ/ｍＬ、1000ｎｇ/ｍＬ的标准血浆,按“血浆样品处理”项下操作,每一浓度进行5样本分析,计算回收率,结果见表ｌ。另用大鼠空白血浆配制含灯盏乙素分别为10ｎｇ/ｍＬ、100ｎｇ/ｍＬ、1000ｎｇ/ｍＬ的标准血浆,测定日内、日间ＲＳＤ,结果见表1。
2.5 稳定性考察
初步考察了灯盏乙素在不同条件的稳定性其血浆样品在冷冻-融化循环三次实验,测定灯盏乙素的浓度无明显降低(ＲＳＤ<8%),可满足血浆样品的冰冻条件。
2.6 灯盏乙素在大鼠体内药代动力学研究
ＳＤ大鼠10只,按体重随机分为2组,每组5只,每只大鼠间隔一定时间取血,每个取血点有5个样本,即第一组动物取血时间点分别为0.75ｈ2ｈ、6ｈ、12ｈ、24ｈ;第二组动物取血时间点分别为1ｈ、3.5ｈ、9ｈ、20ｈ、32ｈ。给药前禁食12ｈ,全程不禁饮水。用5%碳酸氢钠水溶液配制一定浓度的灯盏乙素液,ｉｇ20ｍｇ/ｋｇ,于不同时间点由眼眶后静脉从取血约500μＬ,置于肝素化离心试管中,离心分离血浆,按“血浆样品处理”项下操作,测定得大鼠单次ｉｇ灯盏乙素的平均血药浓度—时间曲线结果见图2。
用中国药理学会3Ｐ87实用药代计算程序处理。自动进行推算、模型、权重选择,拟合的药—时曲线符合ｐｏ给药二室模型,有关药代动力学参数见表2。
3 讨论
总体评价灯盏乙素的血浆浓度测定方法较少,主要采用ＵＶ-ＨＰＬＣ和ＬＣ/ＭＳ/ＭＳ。其中有些方法条件要求高,有的不够稳定,有的最低检测限达不到要求。本文建立的ＨＰＬＣ-ＥＣＤ检测灯盏乙素,国内尚未见报道。研究表明本法灵敏可行,仅须血浆0.2ｍＬ,方法精密度均小于10%;提取回收率平均为100%,较为稳定。并成功应用大鼠的血药浓度测定,证明可以应用于药动学的研究。
在对血样的前期预处理过程中,发现若由于涡旋时间不足,或离心力过大都会导致对测定物质提取不够完全而使测定结果偏低,且不稳定。观察发现,若将流动相的ｐＨ值降低后,可使灯盏乙素的峰形变锐,灵敏度提高;但考虑到过低的ｐＨ值对色谱柱寿命不利,在保持最佳分离的前提下,将流动相ｐＨ值控制在3.0左右较为理想。
蒋学华等报道灯盏乙素犬血浆浓度随时间的变化符合三室模型,本文拟合后符合二室模型。蒋学华等报道的消除半衰期约为52ｍｉｎ,本文为9ｈ,两者差别较大,可能是由于种属差异导致。本文测得灯盏乙素的ＡＵＣ及Ｃｍａｘ较低,可能主要是由于本文的给药剂量(约20ｍｇ/ｋｇ)较低所致。
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