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摘要：建立茄根中绿原酸含量的反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定法。方法色谱柱为YMC-PackODS-AA(150mm×4.6mm,5μm)，以乙腈-甲酸水的梯度流动相洗脱，检测波长323nm，流速1ml·min-1,柱温30℃。
茄根为土家族常用药物之一，来源于茄科茄SolamummelongenaL.的干燥根，具有祛风利湿、清热止血、散瘀消肿等功效。主治牙痛、风湿热痹、冻疮、脚气、血痢、便血等。茄根含有酚类、有机酸、生物碱、皂苷、鞣质等多种成分。实验表明酸性组分是茄根抗炎的主要有效部位,对多种炎症具有很好的治疗效果［1］。目前有关茄根酸性成分的研究目前报道甚少。茄是我国主要蔬菜品种之一，全国各地广为种植。茄收获之后产出大量茄根。本文探索建立了采用RP-HPLC测定茄根中酸性成分——绿原酸的定量分析方法。该方法简便快速，待测组分分离度好，精密度及准确度高，稳定性好，可为茄根的深入开发利用以及质量标准的制订提供研究基础。
1仪器与试药
Varian210分析型高效液相色谱系统(210型二元梯度泵、210型紫外检测器，美国Varian公司)；ME215S型十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；KQ-500DB型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；乙腈为色谱纯(fisher公司)，水为二次蒸馏水(自制)。茄根：采自中国湖北长阳；对照品：绿原酸，购自Sigma公司，纯度≥98%。
2方法与结果
2.1色谱条件YMC-PackODS-AA(150mm×4.6mm,5μm)色谱柱；柱温30℃；流速1ml·min-1；检测波长323nm；进样量20μl；流动相为乙腈(B)-0.5%甲酸水(A)梯度流动相，见表1。在优化的色谱条件下，对照品与供试品的保留时间一致(14.7min)，供试品中绿原酸成分达到有效分离,分离度大于1.5。对照品以及供试品的色谱图见图1。表1流动相(略)
2.2对照品溶液制备精密称取绿原酸对照品适量，加重蒸馏水制成每毫升含1mg的绿原酸溶液，作为对照品溶液贮备液，低温保藏备用。
2.3供试品溶液的制备称取茄根粉末(60目筛，50℃烘干)约2g，置10ml容量瓶中，加入70%甲醇至刻度，室温下浸渍8h，40℃超声2h,用70%甲醇补足溶剂至刻度。过滤，制成每毫升含0.2g的茄根溶液，作为供试品溶液，低温保藏备用。临用时以0.22μm滤膜滤过。
2.4线性关系考察分别吸取对照品贮备液适量，配制成0.005,0.01,0.02,0.03,0.04mg·ml-1的系列对照品溶液，按“2.1”色谱条件分别进样20μl，记录色谱峰面积。以色谱峰面积(Y,mAU)为纵坐标，以对照品溶液浓度(X,mg·ml-1)为横坐标，进行线性回归，得对照品的回归方程：,Y=71.054X-0.115，r=0.9998。线性范围0.005～0.04mg·m-1。
2.5精密度实验精密吸取各对照品溶液20μl，按“2.1”中色谱条件连续进样，测定平均色谱峰面积为12941685，计算RSD为1.2%。表明仪器的精密度良好。
2.6重复性实验精密称取6份茄根药材粉末各2.0g,按“2.3”方法平行制备，在上述色谱条件下进行分析，测定色谱峰面积，计算茄根样品中绿原酸的平均质量分数为0.110mg·g-1，其RSD为1.8%。
2.7稳定性实验精密吸取供试品溶液20μl，分别在0，4，8，24h进样分析，记录色谱峰面积，测定平均峰面积为16611613，计算RSD为3.4%，表明24h内供试品溶液稳定性良好。
2.8回收率实验取已知绿原酸含量的茄根样品9份，每份约1g，精密称定。平均为3组。各样品分别加入已知浓度的对照品贮备液适量,按供试品溶液制备方法平行制备。按“2.1”中色谱条件，分别进样20μl进行测定。结果绿原酸的平均回收率(n=9)为98.51%，RSD为2.7%。结果见表2。表2回收率实验结果(略)
2.9样品分析取茄根样品(60目筛，50℃烘干至恒重)6份，每份约2.0g，精密称定。按“2.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行分析测定。以20μl进样，测定色谱峰峰面积，根据标准曲线计算样品中绿原酸的质量分数。绿原酸平均质量分数为0.108mg·g-1，RSD为2.4%。结果见表3。表3样品中绿原酸含量(略)
3讨论
3.1供试品制备方法的考察本实验比较了不同浸提方法(冷浸、回流和不同温度下超声)和不同提取时间(30,60,120min)的提取效果，考察了不同浓度的溶剂以及不同固液比的提取率，发现采用40℃超声浸提2h，固液比为1∶5，提取溶剂为70%甲醇具有最佳的提取效率，能够提出茄根中绿原酸成分。
3.2色谱条件的选择为了能在适宜的分析时间内获得指标成分的完全分离，在实验中分别用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-磷酸水等体系进行洗脱，发现甲醇-水洗脱基线不平稳，分离度差，乙腈-水洗脱基线平稳，但分离度仍不够好，而乙腈-甲酸水和乙腈-磷酸水体系的分离效果同乙腈-水体系的分离效果相比较有了进一步改善。故最终确定用乙腈-甲酸水体系为流动相。这是因为绿原酸具有邻苯二酚多羟基结构,常以盐的形式存在于植物中,酸性条件有利于其测定,并且合适的酸度还能改善峰形［2］。实验中还对不同波长、柱温和流速进行了考察,发现在检测波长323nm处茄根中绿原酸成分有较强的紫外吸收,同时为保证茄根中绿原酸达到有效分离，在其色谱峰的保留时间段保持较小的梯度变化。
本文对采用超声辅助浸提的方法制备茄根供试品，建立了RP-HPLC法测定茄根中绿原酸的含量。测得茄根中绿原酸含量为0.108mg·g-1，RSD为2.4%。同时还进行了方法学验证，精密度实验RSD值为1.2%；重现性实验的RSD值为1.8%；稳定性实验的RSD值为3.4%(0～24h)；回收率为98.51%，RSD值为2.7%，结果表明方法的精密度、稳定性、回收率等指标满足测定需要。绿原酸具有抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤等生物活性［3］。本研究为茄根中药材质量标准的制订提供科学依据，也为深入开发利用茄根提供研究基础。
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